HPLC vs. Massenspektrometrie bei Peptidtests: Was ist der Unterschied?

Beim Kauf von Forschungspeptiden begegnen Ihnen möglicherweise Laborberichte mit Angaben wie 99 % HPLC-Reinheit oder Identität durch Massenspektrometrie bestätigt.

Doch was bedeuten diese Ergebnisse tatsächlich? Und woran erkennt man, ob ein Peptid angemessen untersucht wurde?

Zwei der am häufigsten verwendeten analytischen Verfahren für Peptide sind:

• Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
• Massenspektrometrie (MS)

Beide Methoden helfen Forschenden bei der Bewertung von Peptidproben, erfüllen jedoch unterschiedliche Aufgaben.

Einfach gesagt: HPLC hilft dabei, die Reinheit einer Peptidprobe zu beurteilen, während die Massenspektrometrie hilft, die enthaltenen Moleküle zu identifizieren.

Wer diesen Unterschied versteht, kann ein Analysenzertifikat (Certificate of Analysis, COA) besser interpretieren und erkennen, was ein Laborbericht nachweist – und was nicht.

HPLC steht für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Dabei handelt es sich um ein Laborverfahren, mit dem verschiedene Stoffe in einer Probe getrennt werden.

Bei der Herstellung eines Peptids können im Endmaterial geringe Mengen unerwünschter Substanzen verbleiben, beispielsweise:

• Unvollständige Peptidsequenzen
• Peptide mit fehlerhaften Aminosäuresequenzen
• Nebenprodukte des Herstellungsprozesses
• Bestimmte Abbauprodukte

Mit HPLC können Labore das gewünschte Peptid von vielen dieser Verunreinigungen trennen.

Stellen Sie sich vor, ein Gemisch verschiedener Substanzen fließt durch eine spezielle Laborsäule.

Jede Substanz wechselwirkt anders mit dem Material in der Säule. Einige passieren sie schnell, andere benötigen mehr Zeit.

Beim Austritt aus der Säule werden die Substanzen von einem Detektor erfasst. Dabei entsteht eine grafische Darstellung, das sogenannte Chromatogramm.

Das Diagramm enthält Peaks, die die erfassten Stoffe darstellen.

Ein großer Peak steht üblicherweise für die Hauptkomponente, kleinere Peaks können Verunreinigungen anzeigen.

Ein Chromatogramm könnte beispielsweise folgende Werte zeigen:

In diesem vereinfachten Beispiel würde die angegebene HPLC-Reinheit etwa 99,1 % betragen.

Das Ergebnis hängt allerdings von der Analysemethode und der Detektorantwort auf die jeweiligen Verbindungen ab. Manche Verunreinigungen bleiben möglicherweise unentdeckt, andere überlagern den Hauptpeak.

Wichtig: Ein HPLC-Reinheitswert von 99,1 % bedeutet nicht automatisch, dass 99,1 % des gesamten Fläschchengewichts auf das gewünschte Peptid entfallen.

Die Massenspektrometrie, kurz MS, ist ein analytisches Verfahren zur Untersuchung der molekularen Identität von Substanzen.

Jedes Peptid besitzt eine chemische Struktur, die durch die Zusammensetzung und Reihenfolge seiner Aminosäuren bestimmt wird. Daraus ergibt sich eine charakteristische Molekülmasse.

Mithilfe der Massenspektrometrie können Labore überprüfen, ob die Molekülmasse einer erfassten Verbindung mit der des erwarteten Peptids übereinstimmt.

Ein Massenspektrometer wandelt Moleküle in geladene Teilchen um, die Ionen genannt werden.

Anschließend werden diese Ionen anhand ihres Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z) analysiert.

Das Gerät erstellt ein Massenspektrum, aus dem Forschende Informationen über die Molekülmassen der nachgewiesenen Verbindungen gewinnen.

Nehmen wir an, ein Labor erwartet ein Peptid mit einer Molekülmasse von ungefähr 1.000 Dalton.

Wenn die MS-Ergebnisse mit dieser erwarteten Molekülmasse vereinbar sind, unterstützt dies die Identifizierung des Peptids.

Die Übereinstimmung der Molekülmasse allein beweist jedoch nicht, dass die gesamte Aminosäuresequenz korrekt ist.

Unterschiedliche Peptide können identische oder sehr ähnliche Massen besitzen. Für eine stärkere Identitätsbestätigung nutzen Labore gegebenenfalls Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS), Referenzstandards oder weitere Analyseverfahren.

Obwohl HPLC und Massenspektrometrie oft gemeinsam genannt werden, beantworten sie unterschiedliche wissenschaftliche Fragen.

So lässt sich der Unterschied am einfachsten merken:

Beide Fragen sind bei der Bewertung von Forschungspeptiden wichtig.

Eine besonders häufige Aussage in Peptid-Laborberichten lautet, eine Probe habe 99 % Reinheit.

Diese Zahl wird jedoch häufig missverstanden.

Bei einer typischen HPLC-UV-Auswertung anhand der Peakflächen bedeutet 99 % Reinheit, dass der Hauptpeak etwa 99 % der integrierten Fläche der erfassten Peaks unter den Prüfbedingungen ausmacht.

Das bedeutet nicht zwangsläufig, dass:

• Das Fläschchen zu 99 % seines Gesamtgewichts aus Peptid besteht.
• Das Fläschchen die angegebene Milligrammmenge enthält.
• Die Peptididentität zweifelsfrei bestätigt wurde.
• Die Probe steril oder frei von Endotoxinen ist.
• Jede denkbare Verunreinigung nachgewiesen wurde.

Diese Unterscheidung ist besonders wichtig, da Peptidzubereitungen auch Wasser, Gegenionen, Restlösungsmittel oder andere Stoffe enthalten können, die durch einen HPLC-Reinheitsprozentsatz nicht ausreichend erfasst werden.

Eine Probe kann beispielsweise 99 % HPLC-Reinheit aufweisen, obwohl ihr tatsächlicher Peptidgehalt geringer ist als erwartet.

Das bedeutet nicht automatisch, dass die Reinheitsprüfung falsch ist. Vielmehr handelt es sich bei Reinheit und tatsächlichem Peptidgehalt um unterschiedliche Messgrößen.

Weitere wissenschaftliche Hintergründe finden Sie in Reference Standards to Support Quality of Synthetic Peptide Therapeutics.

LC-MS steht für Flüssigkeitschromatographie–Massenspektrometrie.

Dabei wird die chromatographische Trennung mit der Detektion durch Massenspektrometrie kombiniert.

Der Ablauf ist folgender:

1. Die Flüssigkeitschromatographie trennt die verschiedenen Bestandteile der Probe.
2. Die getrennten Verbindungen gelangen in ein Massenspektrometer.
3. Das Massenspektrometer misst deren Masse-zu-Ladung-Verhältnisse.
4. Forschende nutzen die kombinierten Daten zur Untersuchung der Peptididentität und möglicher Verunreinigungen.

Diese Kombination ist besonders nützlich, weil zwei Stoffe, die mit einem herkömmlichen HPLC-Detektor schwer unterscheidbar sind, unterschiedliche MS-Signale erzeugen können.

LC-MS kann außerdem helfen, bestimmte Verunreinigungen zu identifizieren, die als separate chromatographische Peaks auftreten.

LC-MS ist jedoch kein Universaltest für sämtliche Kontaminanten. Die Leistungsfähigkeit hängt von der Ausrüstung, der Probenvorbereitung, der Methodenentwicklung und den untersuchten Verbindungen ab.

Ja. Beide Verfahren können helfen, Verunreinigungen zu identifizieren oder zu quantifizieren, besitzen jedoch unterschiedliche Stärken und Grenzen.

HPLC kann zusätzliche Bestandteile sichtbar machen, wenn sie vom Hauptpeptid getrennt werden und messbare Signale erzeugen.

Massenspektrometrie kann anhand der Molekülmassen und gegebenenfalls der Fragmentierungsmuster helfen, einige dieser Bestandteile näher zu bestimmen.

Mögliche Peptidverunreinigungen sind beispielsweise:

• Deletionssequenzen: Peptide, denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen.
• Verkürzte Peptide: Peptide, die kürzer als die beabsichtigte Sequenz sind.
• Oxidierte Peptide: Peptide, die chemisch oxidiert wurden.
• Desamidierte Peptide: Peptide, die durch chemische Desamidierung verändert wurden.
• Weitere syntheseabhängige Verunreinigungen: Unerwünschte Produkte, die während der Herstellung entstehen.

Einige dieser Verunreinigungen sind mit HPLC allein schwer zu unterscheiden, insbesondere wenn sie zu ähnlichen Zeiten aus der Säule austreten.

Forschung mit hochauflösender Massenspektrometrie hat gezeigt, wie wertvoll weiterführende Methoden bei der Untersuchung chromatographisch überlappender Peptidverunreinigungen sind.

Dennoch ersetzen weder HPLC noch gewöhnliche MS-Tests spezielle Untersuchungen auf Sterilität, Endotoxine oder Schwermetalle.

Eine der wichtigsten Erkenntnisse der Peptidanalytik lautet: Reinheit, Identität und Gehalt sind nicht dasselbe.

Betrachten wir ein hypothetisches Peptid mit der Aufschrift 10 mg.

Ein Labor könnte folgende Werte berichten:

• HPLC-Reinheit: 99,2 %
• Massenspektrometrie: Molekülmasse entspricht der erwarteten Peptidmasse
• Quantitative Gehaltsbestimmung: 9,5 mg pro Fläschchen

Diese Ergebnisse widersprechen sich nicht.

Der erste Wert beschreibt die chromatographische Reinheit, der zweite stützt die molekulare Identität und der dritte misst die vorhandene Menge.

Um die Qualität einer Probe vollständig zu verstehen, müssen alle Ergebnisse getrennt interpretiert werden.

Ein Analysenzertifikat (Certificate of Analysis, COA) ist ein Labordokument, das die Ergebnisse der Untersuchungen einer bestimmten Probe zusammenfasst.

Bei der Prüfung eines Peptid-COA ist entscheidend, welche Tests tatsächlich durchgeführt wurden und welche Aussagen sich aus ihnen ableiten lassen.

Ein aussagekräftiger Laborbericht kann enthalten:

• Probenidentifikation: Peptidname, Probenreferenz und Chargen- oder Losnummer.
• Prüfdatum: Zeitpunkt der Analyse.
• HPLC-Reinheit: Angegebener chromatographischer Reinheitswert.
• Chromatogramm: Diagramm der erfassten Peaks.
• MS-Ergebnisse: Angaben zur Molekülmasse als Hinweis auf die Peptididentität.
• Quantitativer Gehalt: Gemessene Peptidmenge, sofern eine geeignete Analyse durchgeführt wurde.
• Laborangaben: Prüfende Organisation und Berichtsreferenz.

Ein COA mit 99 % HPLC-Reinheit und einer zum Peptid passenden Molekülmasse liefert beispielsweise nützliche Analysedaten.

Es darf jedoch nicht als Nachweis für erfolgreich bestandene Prüfungen gelten, die niemals durchgeführt wurden.

Auch die ursprünglichen Rohdaten, die Prüfmethodik und die Rückverfolgbarkeit der Probe sind für die Beurteilung der Zuverlässigkeit wichtig.

Weder HPLC noch Massenspektrometrie ist grundsätzlich überlegen. Beide erfüllen unterschiedliche Zwecke.

HPLC eignet sich besonders zur Beurteilung der chromatographischen Reinheit und zur Trennung peptidbezogener Verunreinigungen.

Massenspektrometrie ist besonders hilfreich, wenn die molekulare Identität untersucht oder bestimmte Verunreinigungen identifiziert werden sollen.

Für eine umfassendere Bewertung kombinieren Labore deshalb häufig HPLC und Massenspektrometrie und setzen bei Bedarf weitere Verfahren ein.

Die seit Juni 2026 geltende Leitlinie der Europäischen Arzneimittel-Agentur zur Entwicklung und Herstellung synthetischer Peptide empfiehlt ergänzende analytische Ansätze zur Charakterisierung von Identität und Verunreinigungen. Das ist besonders relevant, weil sich manche Verunreinigungen bei der Chromatographie überlagern können.

Welche Prüfungen geeignet sind, hängt vom Peptid, dem Untersuchungszweck und den zu bewertenden Qualitätsmerkmalen ab.

Kann HPLC bestätigen, dass ein Peptid echt ist?

HPLC kann Informationen zur Reinheit liefern und bei Vergleich mit einem geeigneten Referenzstandard die Identifizierung unterstützen. Ein HPLC-Reinheitswert allein bestätigt die molekulare Identität jedoch normalerweise nicht zweifelsfrei.

Misst Massenspektrometrie die Reinheit von Peptiden?

MS kann bei der Untersuchung von Verunreinigungen helfen und mit einer geeigneten Methode auch quantitativ eingesetzt werden. Die bloße Bestätigung einer Molekülmasse liefert aber keinen umfassenden Reinheitsprozentsatz.

Bedeutet 99 % HPLC-Reinheit, dass das Fläschchen die korrekte Menge enthält?

Nein. HPLC-Peakflächenreinheit und tatsächlicher Peptidgehalt sind unterschiedliche Messgrößen. Zur Mengenbestimmung ist eine geeignete quantitative Analyse erforderlich.

Was ist der Unterschied zwischen HPLC-MS und LC-MS?

HPLC-MS bezeichnet die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit angeschlossener Massenspektrometrie. LC-MS ist der allgemeinere Begriff für Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit MS. In der Peptidanalytik werden damit häufig ähnliche kombinierte Verfahren bezeichnet.

Können HPLC und MS die Sicherheit eines Peptids für den Menschen bestätigen?

Nein. Diese Untersuchungen allein belegen weder Sicherheit noch Sterilität, Endotoxingehalte oder Eignung zur Anwendung am Menschen. Für Arzneimittel gelten weitere Prüfungen und regulatorische Anforderungen.

Sollten alle Forschungspeptide mit HPLC und MS getestet werden?

Sich ergänzende Methoden liefern umfassendere Informationen als ein einzelner Reinheitstest. Welche Analysen erforderlich sind, hängt jedoch vom Material, der vorgesehenen Laboranwendung und dem Prüfzweck ab.

HPLC und Massenspektrometrie sind zwei grundlegende analytische Verfahren in der modernen Peptidprüfung.

HPLC unterstützt die Trennung von Peptidverbindungen und die Beurteilung chromatographischer Reinheit, während MS molekulare Informationen für die Identifizierung und Untersuchung von Verunreinigungen liefert.

Gemeinsam ermöglichen sie ein detaillierteres Bild einer Peptidprobe als jede Methode für sich allein.

Keine von beiden belegt jedoch automatisch die tatsächliche Peptidmenge, Sterilität oder allgemeine Eignung für eine bestimmte Anwendung.

Für Forschende, die Laborberichte bewerten, gilt daher ein einfacher Grundsatz:

Peptidreinheit, molekulare Identität und tatsächlicher Gehalt sind eigenständige Qualitätsgrößen, die jeweils durch geeignete analytische Nachweise belegt werden müssen.

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