Steriliteitstests voor Peptiden: Methoden, Beperkingen en Laboratoriumnormen

Peptiden zijn korte ketens van aminozuren die worden gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, biotechnologie en geneesmiddelenontwikkeling.

Tijdens productie, verpakking, opslag of hantering van peptiden kan microbiële besmetting ontstaan. Bacteriën, schimmels of andere micro-organismen kunnen daardoor in het product terechtkomen.

Een steriliteitstest is een laboratoriumprocedure waarmee wordt onderzocht of in een getest monster levensvatbare micro-organismen aantoonbaar zijn.

Voor onderzoekslaboratoria levert zo'n test waardevolle informatie over de microbiologische kwaliteit van materialen, vooral bij onderzoek naar steriele formuleringen.

Een belangrijke beperking blijft echter: een geslaagde steriliteitstest garandeert niet dat elk flesje uit een partij steriel is.

Steriliteitsborging hangt ook af van de productie, hantering, verpakking en opslag van een product.

Microbiële besmetting kan de betrouwbaarheid en consistentie van laboratoriumexperimenten beïnvloeden.

Afhankelijk van de onderzoeks toepassing kan besmetting:

• Experimentele resultaten verstoren.
• Ongewenste biologische activiteit veroorzaken.
• De stabiliteit van een peptideformulering beïnvloeden.
• Celkweken en andere gevoelige laboratoriumsystemen aantasten.
• Het reproduceren van onderzoeksresultaten bemoeilijken.

Onderzoekers die een peptide in een gevoelige celkweek bestuderen, kunnen bijvoorbeeld misleidende resultaten krijgen wanneer het monster besmet is.

Steriliteitstests helpen bepaalde besmettingsrisico's zichtbaar te maken, maar vervangen geen andere kwaliteitscontroles.

Het is belangrijk onderscheid te maken tussen materialen voor onderzoek en steriele geneesmiddelen. Een etiket met 'uitsluitend voor onderzoek' betekent niet automatisch dat het product steriel of geschikt voor toediening aan mensen is.

Een veelvoorkomend misverstand is dat een hoge chemische zuiverheid hetzelfde is als steriliteit. Het gaat om verschillende kwaliteitskenmerken.

Testen van chemische zuiverheid

Peptidezuiverheid wordt vaak gemeten met hogeprestatievloeistofchromatografie (HPLC).

Een peptide kan bijvoorbeeld een gerapporteerde HPLC-zuiverheid van 99% hebben.

Dit percentage beschrijft chromatografische zuiverheid volgens de toegepaste methode. Het betekent niet noodzakelijk dat 99% van de totale massa in het flesje uit het gewenste peptide bestaat en bewijst niet dat het monster steriel is.

Steriliteitstests

Een steriliteitstest zoekt naar levensvatbare micro-organismen die onder vastgestelde laboratoriumomstandigheden kunnen groeien.

Als geen groei wordt waargenomen, kan het monster aan de testeisen voldoen.

Micro-organismen in zeer kleine hoeveelheden, ongelijkmatig verdeeld, beschadigd of niet kweekbaar onder de gekozen omstandigheden kunnen echter onopgemerkt blijven.

Endotoxinetests

Endotoxinen zijn bestanddelen die verband houden met het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën.

Ze kunnen aanwezig blijven nadat de bacteriën zelf zijn gedood.

Daarom kan een peptidemonster slagen voor een steriliteitstest en toch bacteriële endotoxinen bevatten.

Beide tests beantwoorden dus verschillende vragen.

Belangrijk: een peptide kan chemisch zuiver zijn, de steriliteitstest doorstaan en toch extra kwaliteitsonderzoek nodig hebben afhankelijk van de beoogde laboratoriumtoepassing.

Traditionele methoden staan onder meer beschreven in de Europese Farmacopee en de United States Pharmacopeia (USP).

Twee gevestigde benaderingen zijn membraanfiltratie en directe inoculatie.

1. Membraanfiltratie

Membraanfiltratie wordt veel toegepast wanneer het monster goed kan worden gefilterd.

Het algemene proces bestaat uit:

1. Een voorbereid monster door een speciaal membraan leiden dat micro-organismen vasthoudt.
2. Het membraan, of delen ervan, overbrengen naar geschikte kweekmedia.
3. De media onder vastgestelde omstandigheden incuberen.
4. Controleren of micro-organismen groeien.

Wanneer aanwezige micro-organismen onder de testomstandigheden kunnen groeien, kunnen zichtbare tekenen van besmetting ontstaan.

Een belangrijk voordeel is dat micro-organismen kunnen worden gescheiden van stoffen die hun groei mogelijk remmen.

De methode is echter niet geschikt voor elke peptideformulering. Oplosbaarheid, filtreerbaarheid en antimicrobiële eigenschappen kunnen de test bemoeilijken.

2. Directe inoculatie

Directe inoculatie is een andere erkende steriliteitstest.

Het laboratorium brengt een geschikte hoeveelheid monster rechtstreeks in kweekmedia, in plaats van eerst te filtreren.

Daarna worden de media geïncubeerd en gecontroleerd op microbiële groei.

Deze aanpak is nuttig wanneer filtratie ongeschikt is.

Sommige peptiden of bestanddelen van de formulering kunnen echter de groei van micro-organismen remmen.

Daardoor kan een besmet monster mogelijk toch een negatief resultaat geven.

Om dat risico te beoordelen voeren laboratoria een geschiktheidstest uit om aan te tonen dat relevante micro-organismen in aanwezigheid van het product kunnen worden gedetecteerd.

Bij traditionele steriliteitstests worden verschillende kweekmedia en incubatieomstandigheden gebruikt om de groei van uiteenlopende micro-organismen te ondersteunen.

Veelgebruikte media zijn:

• Vloeibaar thioglycolaatmedium (FTM): vooral voor detectie van bepaalde anaerobe en aerobe bacteriën.
• Soja-caseïnedigestmedium (SCDM), ook tryptic soy broth genoemd: ondersteunt de groei van aerobe bacteriën en schimmels.

Het doel is niet om elk mogelijk micro-organisme afzonderlijk te identificeren.

De test onderzoekt of levensvatbare micro-organismen onder de vastgestelde omstandigheden kunnen worden teruggewonnen.

Sommige soorten zijn moeilijk te kweken, groeien langzaam of hebben omstandigheden nodig die een standaardtest niet biedt.

Daarom is een negatief resultaat nooit absoluut bewijs dat geen micro-organismen aanwezig zijn.

Traditionele farmacopeïsche steriliteitstests vereisen doorgaans minimaal 14 dagen incubatie, afhankelijk van de methode en gevalideerde omstandigheden.

Zo krijgen veel relevante micro-organismen voldoende tijd om tot detecteerbare aantallen te groeien.

Het proces omvat meestal monstervoorbereiding, beoordeling van de geschiktheid, incubatie, observatie en beoordeling van de uitkomsten.

Kunnen steriliteitstests sneller worden uitgevoerd?

Ja. Sommige laboratoria gebruiken snelle microbiologische methoden om besmetting eerder te signaleren.

Voorbeelden zijn:

• Geautomatiseerde systemen voor detectie van microbiële groei.
• Op ATP gebaseerde bioluminescentie.
• Vastefasecytometrie.
• Moleculaire technieken zoals PCR.
• Andere gevalideerde snelle microbiologische methoden.

Bepaalde methoden leveren binnen enkele dagen resultaten op in plaats van na de traditionele incubatieperiode.

Maar een snellere test is niet automatisch gelijkwaardig aan een farmacopeïsche steriliteitstest.

Een alternatieve methode moet passend gevalideerd worden voor het beoogde gebruik en voldoende gevoeligheid, specificiteit en robuustheid aantonen.

De daadwerkelijke doorlooptijd hangt af van techniek, monsterkenmerken, laboratoriumprocedures en validatie.

Steriliteitstests zijn belangrijke kwaliteitsinstrumenten, maar hebben wetenschappelijke beperkingen die bij het lezen van rapporten moeten worden meegenomen.

1. Alleen een steekproef wordt onderzocht

Een laboratorium test normaal een bepaald aantal eenheden uit een productiepartij en niet elk flesje apart.

Als slechts een klein deel besmet is, hoeven de gekozen monsters de besmette eenheden niet te bevatten.

Een geslaagde test bewijst daarom niet dat elk flesje vrij is van besmetting.

2. Zeer lage besmettingsniveaus kunnen worden gemist

De tests zijn afhankelijk van het terugvinden van levensvatbare micro-organismen uit het monster.

Bij een zeer geringe besmetting is de kans klein dat het onderzochte deel een micro-organisme bevat.

Ook kunnen micro-organismen ongelijkmatig over de partij zijn verdeeld.

3. Sommige peptiden kunnen de test verstoren

Bepaalde peptideverbindingen of hulpstoffen kunnen antimicrobiële werking hebben.

Als het monster de groei remt, kunnen aanwezige micro-organismen onopgemerkt blijven.

Daarom is een methodegeschiktheidstest bijzonder belangrijk.

Het laboratorium moet aantonen dat micro-organismen ondanks mogelijke effecten van het monster kunnen worden teruggewonnen.

4. Niet alle micro-organismen groeien onder standaardomstandigheden

Traditionele tests zijn afhankelijk van microbiële groei.

Organismen die niet in de gekozen media of incubatieomstandigheden groeien, kunnen buiten beeld blijven.

Ook verschillen micro-organismen in terugwinbaarheid en groeisnelheid.

5. Testen vervangen productiecontroles niet

Een steriliteitstest onderzoekt een monster op een bepaald moment.

De test kan op zichzelf niet aantonen dat productie, verpakking, vervoer en opslag op de juiste manier zijn verlopen.

Steriliteitsborging berust daarom op meerdere kwaliteitsmaatregelen en niet op één uitslag.

Verschillende internationaal erkende normen bieden richtlijnen voor farmaceutische steriliteitstests en microbiologische kwaliteitscontrole.

Europese Farmacopee 2.6.1

De Europese Farmacopee bevat kwaliteitsnormen voor geneesmiddelen en farmaceutische stoffen in Europa.

Hoofdstuk 2.6.1 beschrijft erkende methoden voor steriliteitsonderzoek.

Het is een belangrijk uitgangspunt voor producten die aan farmacopeïsche steriliteitseisen moeten voldoen.

USP <71> — Sterility Tests

USP <71> is een internationaal erkende norm voor farmaceutische steriliteitstests.

Deze beschrijft onder andere membraanfiltratie en directe inoculatie, inclusief de bijbehorende eisen.

Geneesmiddelenproducenten en analytische laboratoria gebruiken deze norm regelmatig.

EU-GMP-bijlage 1

Bijlage 1 van de Europese goede fabricagepraktijken behandelt de vervaardiging van steriele geneesmiddelen.

De nadruk ligt op het voorkomen van besmetting, omgevingsbewaking, geschikte faciliteiten, gevalideerde processen en kwaliteitsborging.

Een kernprincipe is dat de steriliteit niet uitsluitend door een test van het eindproduct kan worden gegarandeerd.

Goede productiecontroles zijn daarom essentieel.

ISO/IEC 17025

ISO/IEC 17025 is een internationale norm voor de deskundigheid van test- en kalibratielaboratoria.

Een geaccrediteerd laboratorium is beoordeeld voor specifieke werkzaamheden binnen de accreditatiescope.

Accreditatie betekent niet dat het laboratorium voor elk type test gekwalificeerd is.

Controleer daarom of de benodigde microbiologische methode onder de geaccrediteerde scope valt.

Onafhankelijke laboratoriumtests kunnen nuttige informatie geven over peptidekwaliteit.

Maar onderzoekers moeten begrijpen wat een laboratoriumrapport werkelijk aantoont.

Een goed gedocumenteerd rapport vermeldt monster, methode, omstandigheden en uitkomst.

Waar moet je op letten?

• Monsteridentificatie: peptidenaam, formulering en herkenbare kenmerken.
• Batch- of lotnummer: koppeling met een specifieke productiepartij.
• Testlaboratorium: naam en identiteit van de uitvoerende instantie.
• Testmethode: gebruikte procedure en toepasselijke norm.
• Methodegeschiktheid: bewijs dat micro-organismen in aanwezigheid van het monster aantoonbaar zijn.
• Testdata: datum van ontvangst en onderzoek indien relevant.
• Incubatieomstandigheden: gebruikte omstandigheden en duur.
• Controles: bevestiging dat passende controles correct functioneerden.
• Eindresultaat: waargenomen groei en beoordeling tegen acceptatiecriteria.

Wat betekent 'geen groei gedetecteerd'?

Dit betekent meestal dat onder de testomstandigheden geen aantoonbare microbiële groei is opgetreden.

Als de methode passend en gevalideerd was en aan de criteria voldeed, kan het monster als conform worden gerapporteerd.

Het betekent niet dat elk afzonderlijk flesje in de partij steriel is bevonden.

Maak ook onderscheid tussen een gevalideerde steriliteitstest en een algemene microbiële screening.

Beide leveren informatie, maar de conclusies zijn niet uitwisselbaar.

Veel onderzoekspeptiden worden als lyofilisaat of gevriesdroogd materiaal geleverd.

Lyofilisatie verwijdert water uit de formulering en kan bepaalde stabiliteitskenmerken verbeteren.

Vriesdrogen steriliseert een peptide echter niet automatisch.

Sommige micro-organismen kunnen het vriesdroogproces overleven.

Een volledig droog ogend product kan dus nog steeds levensvatbare micro-organismen bevatten.

Steriliteit hangt af van de productie, oorspronkelijke besmettingscontroles, eventueel gevalideerde sterilisatie, aseptische hantering en verpakkingsintegriteit.

Voor producten die steriel moeten zijn, zijn passende methoden nodig voor de voorbereiding en analyse van gevriesdroogde materialen.

Ook de manier van oplossen en hanteren tijdens het testen kan de betrouwbaarheid van de uitslag beïnvloeden.

Nee. Steriliteit is slechts één aspect van productkwaliteit.

Een peptide kan slagen voor de test en toch andere kwaliteitsproblemen hebben:

• Onjuiste peptide-identiteit.
• Onjuiste hoeveelheid of concentratie.
• Chemische onzuiverheden of afbraakproducten.
• Besmetting met bacteriële endotoxinen.
• Verontreiniging met deeltjes.
• Problemen met stabiliteit of verpakkingsintegriteit.

Een steriliteitstest beoordeelt niet al deze kenmerken.

Bovendien geldt dat een steriel peptide voor onderzoeksdoeleinden niet automatisch geschikt is voor gebruik bij mensen of dieren.

Geneesmiddelen bestemd voor toediening vereisen uitgebreidere controles voor kwaliteit, veiligheid, productie en regelgeving.

Het label 'uitsluitend voor onderzoek' geldt niet als farmaceutische goedkeuring.

Is een peptide met 99% zuiverheid steriel?

Niet noodzakelijk. Een HPLC-zuiverheid van 99% beschrijft de chemische zuiverheid volgens een analysemethode, niet de aanwezigheid van levensvatbare micro-organismen.

Kan een peptide slagen voor steriliteit maar zakken voor endotoxinen?

Ja. De eerste test zoekt aantoonbare levensvatbare micro-organismen; de tweede meet endotoxinen, die achter kunnen blijven nadat bacteriën zijn gestorven.

Doodt vriesdrogen bacteriën?

Niet betrouwbaar. Sommige micro-organismen overleven het proces; lyofilisatie is daarom geen sterilisatiemethode.

Hoe lang duurt een standaardtest?

Traditionele farmacopeïsche methoden vereisen doorgaans ten minste 14 dagen incubatie. Gevalideerde snelle methoden kunnen bij geschikte toepassingen korter duren.

Wordt elk flesje getest?

Meestal niet. Er wordt een vooraf bepaald monster uit de partij onderzocht. Daarom zijn monsternameplannen en productiecontroles belangrijk.

Moeten alle onderzoekspeptiden getest worden?

Niet noodzakelijk. Dit hangt af van de beoogde toepassing, productclassificatie, wetgeving en contractuele of laboratoriumspecificaties. Onderzoeksreagentia vallen niet automatisch onder dezelfde regels als steriele geneesmiddelen.

Wat is het verschil tussen steriliteit en een microbiële telling?

Een steriliteitstest kijkt naar aantoonbare levensvatbare micro-organismen onder bepaalde omstandigheden. Een microbiële telling schat het aantal kweekbare organismen. Een lage telling staat niet gelijk aan een geslaagde steriliteitstest.

Steriliteitstests zijn belangrijk voor de microbiologische beoordeling van peptiden, vooral in onderzoek met gevoelige biologische systemen of steriele formuleringen.

Membraanfiltratie en directe inoculatie zijn erkende methoden om levensvatbare micro-organismen op te sporen.

USP <71>, Europese Farmacopee 2.6.1 en EU-GMP-bijlage 1 geven belangrijke richtlijnen voor tests en steriliteitsborging.

Toch blijven er beperkingen: een negatieve uitslag garandeert niet dat alle flesjes steriel zijn en vervangt geen passende productiecontroles.

Onderzoekers moeten onthouden dat steriliteit, chemische zuiverheid, peptide-identiteit en bacteriële endotoxinegehalten afzonderlijke kwaliteitskenmerken zijn.

Wie deze verschillen begrijpt, kan laboratoriumrapporten beter interpreteren, testdiensten vergelijken en onderzoeksmaterialen beoordelen.

1. United States Pharmacopeia — USP <71>: Sterility Tests
2. European Directorate for the Quality of Medicines — European Pharmacopoeia Harmonisation
3. European Commission — EU GMP Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products
4. European Medicines Agency — Guideline on the Sterilisation of the Medicinal Product, Active Substance, Excipient and Primary Container
5. World Health Organization — Good Manufacturing Practices for Sterile Pharmaceutical Products
6. United States Pharmacopeia — USP <1223>: Validation of Alternative Microbiological Methods
7. United States Pharmacopeia — USP <1071>: Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-Life Products
8. United States Pharmacopeia — USP <61>: Microbial Enumeration Tests
9. United States Pharmacopeia — USP <85>: Bacterial Endotoxins Test
10. United States Pharmacopeia — USP <1207>: Package Integrity Evaluation — Sterile Products
11. FDA — Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Practice
12. FDA — Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers
13. ISO — ISO/IEC 17025:2017, General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories
14. ISO — ISO 14644-1:2015, Classification of Air Cleanliness in Cleanrooms
15. FDA — Container and Closure System Integrity Testing in Lieu of Sterility Testing as a Component of the Stability Protocol
16. Journal of Clinical Microbiology — Sterility Testing for Cellular Therapies: What Is the Role of the Clinical Microbiology Laboratory?
17. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology — Rapid Sterility Test Systems in the Pharmaceutical Industry
18. Scientific Study — Primary Validation Study of a New Generation of Solid Phase Cytometer for Rapid Sterility Testing
19. Scientific Study — Combining a Respiration-Based Method with Universal qPCR for 3-Day Rapid Sterility Testing
20. Journal of Laboratory Automation — Validation of Rapid Microbiological Methods